Application of micro-scale technologies in engineering cell geometry and alignment

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.14.026

Abstract

Abstract:

BACKGROUND: It is of great significance for the research of cell biology, tissue engineering and regenerative medicine to precisely control cell geometry and alignment in vitro. However, there is a lack of systematic study and description of the methods for controlling cell geometry and inducing alignment in vitro.
OBJECTIVE: To summarize the methods of surface chemical treatment technology and surface topographical technology to prepare the substrate for cell growth and to discuss the feasibility and the latest progress in cell shape control and cell alignment.
METHODS: The author performed a data retrieval of PubMed and Bailianyun databases from 1995 to 2017 to search the articles addressing the effects of micro-scale technologies on cell geometry and alignment in vitro, and reviewed the literatures systematically.
RESULTS AND CONCLUSION: With the development of micro-scale technologies and in-depth study on cell behaviors, surface chemical treatment, surface topographical transformation and fibrous scaffolds are gradually developed to precisely control cell geometry and alignment. The surface micropatterning, pillar and pit arrays can precisely control cell geometry, and the topographical patterning dominates cell alignment over the chemical patterns. Surface chemical treatment and topographical patterning can also be combined to preferably engineer cell alignment in vitro. The suitable substrate can be used to control cell geometry precisely, regulate the differentiation of stem cells or induce cell alignment, and promote cell fusion and differentiation.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Cell Biology, Cell Shape, Tissue Engineering

CLC Number:

R318

Liu Xiao-yi, Li Shan, Zhao Feng, He Jing-wen, Sun Yan. Application of micro-scale technologies in engineering cell geometry and alignment[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(14): 2291-2296.

Figures/Tables 1

2.1 表面化学修饰技术许多细胞通过锚定连接粘附并铺展到基底表面才能生长、增殖。其中，黏着斑的形成需要激活α和β链以构成整合素跨膜糖蛋白，细胞表面的整合素胞外受体能够与细胞外基质分子中的特异性配体结合，如存在于玻连蛋白、纤维粘连蛋白和层粘连蛋白中的arginine-glycine-aspatate(RGD)多肽[7]。培养瓶或培养皿中的细胞是通过培养基内的蛋白成分在基底表面瞬时形成蛋白质层而黏附、生长，该蛋白质层能够活化基底表面并增强细胞黏附和迁移。这些现象表明，接种在材料表面的细胞不会直接与基底作用，改变基底表面的化学性质可直接控制细胞在材料表面的黏附和铺展。基底表面化学修饰作用会影响包括细胞黏附、迁移和分化在内的各种细胞生物学行为。细胞对基底表面化学信号的反应基于此特征性信号是否图案化。因此，表面图案化包括一系列表面特征性信号，例如规律性的或特殊设计的图案形状，大小，周期等。表面化学修饰技术在细胞黏附、细胞间相互作用和细胞图案化研究中均有广泛应用，主要包括微接触印刷技术和干剥离技术。 2.1.1 微接触印刷技术微接触印刷技术由Xia等[8]于1994年首次提出，使用聚二甲基硅氧烷弹性印章将硫醇移印至金表面，通过物理作用使金表面形成微图案。在此研究基础上，可在材料表面选择性地吸附蛋白质获得交替排列的图案，以改变基底表面的化学性质，从而实现对细胞的定位黏附，因此微接触印刷技术得到了迅速发展。细胞与细胞外基质相互接触的粘附小岛面积的减小会限制细胞铺展，增大细胞死亡率，并且DNA的合成量也随之降低。为进一步研究细胞铺展面积对细胞生存的影响，可在材料表面设计直径从几微米到几十微米不等的黏附圆岛，通过比较细胞的铺展面积与细胞-细胞外基质的接触面积对细胞生长及凋亡的影响，发现细胞铺展面积比有效黏附面积更能决定细胞的存亡[9]。Yennek等[10]运用微接触印刷技术制备不对称型和对称型的微图案模拟单个鼠肌原细胞的分裂，以研究黏附岛形状对模板DNA链分离的影响，揭示了细胞在不对称型黏附图案上分裂时，DNA分离的非随机性更高。控制微图案为不同面积，但具有恒定边缘曲率的黏附岛可用于研究几何图案对黏附细胞牵引应力的调节作用，研究显示黏着斑主要集中于弯曲区域且数量维持恒定，沿着细胞边缘的局部曲率调节牵引应力的分布和大小以保持恒定的应变能量[11]。Lilge等的研究结果进一步证明了细胞内的肌动蛋白纤维沿着微图案的边界排列，并集中在黏附岛的角落处形成黏着斑。此外，通过微接触印刷技术控制细胞的几何形状，揭示了细胞几何限制会通过由肌动球蛋白收缩性调控的组蛋白去乙酰化酶3在细胞质-核中的重分布诱导模块化的基因表达改变[2]。上述研究表明了微接触印刷技术能够通过改变黏附小岛的形状和尺寸，精确控制细胞形状、大小和铺展，进而研究其对细胞生长、骨架排列、基因表达、凋亡等的影响。 Mcbeath等[13]采用化学微图案吸附纤维粘连蛋白制备面积分别为1 024 μm2和10 000 μm2的正方形黏附小岛，对人间充质干细胞进行诱导分化，培养1周后，发现在较大的微图案上，细胞较好的铺展并倾向于向成骨细胞分化；而在较小的微图案上，细胞铺展程度小呈球形，更容易向成脂细胞分化。而利用微接触印刷技术控制单细胞的几何形状能够研究其对干细胞向脂肪形成或神经发生的影响，圆形黏附小岛可促进脂肪形成；而具有各向异性特征如分支状和椭圆状的黏附区更有利于神经发生[14]。Kilian等[15]进一步研究了相同面积，不同几何形状的微图案对间充质干细胞分化的影响，揭示了在相同黏附面积下，增大矩形的长宽比会相应增加肌动球蛋白收缩力促进成骨细胞形成。因此，微图案技术用来限定单细胞的形状和铺展，可用于对干细胞分化的研究。趋于圆形、面积较小的微图案更有利于脂肪细胞的形成，诱导干细胞的具体和单一分化可能需要与其在机体内的生理状态更为接近，有待进一步研究。诱导细胞体外排列能够促进体内外组织再生的研究。基于体内骨骼肌纤维平行排布和成肌细胞排列分化的线索，Clark等[16]用微图案技术研究表明成肌细胞会以头对尾的形式融合成线性的肌纤维，线性排列的成肌细胞比自由生长的成肌细胞的分化显著增加。Li等[17]使成肌细胞在微图案上进行黏附、排列，进一步表明了 10 μm×200 μm的长方形黏附小岛上的成肌细胞比相同面积的圆形小岛上的成肌细胞分化更多。基于微接触印刷技术可对细胞进行几何排列及成肌细胞的排列影响其分化的研究，Sun等[5]运用微接触印刷技术进一步设计了不同宽度的纤维粘连蛋白条带及不同的蛋白条带间隔，并发现宽度为100 μm、间隔为20 μm的蛋白条带上成肌细胞分化最好，肌管较长，收缩性较强。 2.1.2 干剥离技术干剥离技术是将生物相容性良好的聚对二甲苯沉积在基底上形成薄膜并通过离子刻蚀和光刻蚀使其表面图案化，然后在该复合结构表面孵育并吸附具有生物活性的分子，最后将聚对二甲苯薄膜从基底剥离留下吸附分子，则基底表面被选择性地化学修饰。Martinez等[18]利用具有电绝缘性和化学惰性的聚酰亚胺和干剥离技术在二氧化硅基底表面构图，将神经元细胞在图案上培养12 h后，发现细胞会沿着图案的方向排列，并表明10 μm×10 μm阵列图案更能够引导神经细胞的轴突沿图案大范围伸长。虽然微接触印刷技术和干剥离技术可以使多种生物分子在基底表面图案化，而目前仍然存在一些限制。例如，此微图案方法无法将单细胞和结构化或特征化的排列图案结合。具有多电极阵列的基底对神经元的排列很重要，能够形成图案化的神经网络，即位于基底电极顶部的单个神经元和伸长的轴突，而不仅是神经元胞体的黏附。因此，能够结合单细胞研究和制备功能化排列图案基底的微图案化技术需要进一步深入研究。 2.2 表面拓扑学改造技术机体细胞存在于多种细胞外基质构成的三维微环境中，胞外空间结构和基质内生物、化学因子均对的细胞黏附、生长、迁移和形态上占据决定性作用，其中胞外微环境结构是影响细胞生物学行为的物理因素。机体细胞所处微环境的空间结构与其所构成组织承担的生理功能相适应。具体来说，天然生理组织均在一定程度上表现为某一几何特征在空间上的重复、规律性分布，此物理信号限定了该组织内细胞的铺展形状和生长空间，形成与其所需发挥生理功能相应的形态和结构[19]。例如，骨骼肌组织内空间结构使单核成肌细胞相互识别、黏附并融合成平行排布的肌纤维，细胞的排列对组织的形态形成和肌肉收缩功能的实现至关重要[20]。因此，机体组织内空间微环境的物理影响，是调节细胞生物学行为的重要因素之一。胞外微环境拓扑结构在细胞形态、排列和组织形成上发挥重要作用。体外调控并模拟组织细胞生长微环境的基底表面拓扑形貌技术研究对组织修复和再生具有极其重要的意义。细胞沿着基底拓扑结构取向、迁移和排列，对基底信号做出响应的行为被称为接触诱导。接触诱导行为存在于多种类型细胞中，包括神经元细胞、成纤维细胞、内皮细胞、巨噬细胞和中性粒细胞等。接触诱导在蛋白质合成、细胞生长和排列中均有至关重要的作用[21]。微加工技术的发展使得微纳米尺寸拓扑结构的制备得以实现，拓扑图案与单细胞在微/纳米尺寸的基底黏附高度一致，更利于细胞排列。因此，通过基底拓扑形貌表面的接触诱导可以实现更复杂的细胞定位和排列。目前，表面拓扑学改造技术主要关注于沟槽、微柱、微孔、微波等阵列结构。 2.2.1 沟槽阵列结构目前，对沟槽的研究主要集中在微纳米尺寸凹槽对细胞黏附、生长和排列的控制方面。深反应离子刻蚀、电子束光刻、激光直写、光刻等多种微纳米加工技术已被用于制备沟槽拓扑结构，具有特定槽深度和脊宽度尺寸的规则性微图案。大量研究表明包括成肌细胞、成纤维细胞、上皮细胞等在内的多种不同类型细胞，会以平行于沟槽长轴的方向迁移并排列[22-23]。例如，通过光刻方法在甲基丙烯酸酯基底表面形成微纳米脊槽，可接触诱导神经细胞的轴突根据基底拓扑信息进行体外排列[24]。Wang等[25]在聚苯乙烯表面制备亚微米级微槽形成表面拓扑结构，对成肌细胞进行培养，发现细胞在宽度和深度分别为900 nm/550 nm的沟槽表面分化效率明显高于平面分化效率。此外，通过比较深度为纳米级到亚微米级的凹槽结构对角膜上皮细胞排列的影响，表明细胞能够感知拓扑结构深度的变化，深尺寸沟槽能够增强细胞取向一致性、促进细胞排列[26]。Mobasseri等[27]结合光刻技术图案化硅片基底、湿法刻蚀和干法刻蚀技术浇铸聚己内酯/聚乳酸溶液，分别形成3种不同边缘陡峭度的沟槽结构：V形、倾斜形和直立形边缘，许旺细胞根据V形和倾斜形边缘的沟槽方向铺展、取向且不跨越沟槽；而边缘为直立形的沟槽表面，细胞铺展性较低且更倾向于横跨沟槽生长。因此，沟槽的深度和形状对细胞取向和排列均有明显影响，在一定程度内，增大凹槽深度更利于细胞接触导向。而沟槽宽度对细胞取向性影响的临界点仍存在争议，或与基底材料和细胞种类有关。 2.2.2 微柱阵列结构微柱是能够诱导细胞体外黏附、排列的拓扑结构之一，微柱的高度、几何形状和间隔均可明显影响细胞排列。利用光刻、深反应离子刻蚀技术蚀刻硅表面并浇铸聚二甲基硅氧烷后制备纳米柱阵列诱导间充质干细胞的排列，经培养后发现间充质干细胞在间隔为2 μm的纳米柱阵列上以类似于轴突样的伸长方式排列，此排列方式不同于1 μm和4 μm间隔的纳米柱阵列[28]。Liu等[29]使用聚丙交酯-乙交酯制备微柱阵列研究了细胞核结构对干细胞分化的影响，发现保持微柱截面面积和间隔相同时，细胞核的变形比率为微柱高度的函数，甚至在间充质干细胞诱导成骨或成脂形成几天后，始终维持核变形状态。微柱阵列上的核变形伴随有细胞较小的投影面积，导致间充质干细胞的骨形成增强、脂肪形成减弱。此外，细胞在微柱阵列上的排列还取决于细胞类型。例如，使海马神经元细胞呈现高度排列的微柱阵列，其他细胞(成纤维细胞、上皮细胞)在其表面的排列却与此相反[30]。以上研究表明，基底拓扑结构有可能独立地影响细胞排列、干细胞分化。对于微柱基底在细胞排列方面影响的差异，可能更加具有组织特异性，与细胞种类等相关。 2.2.3 微孔阵列结构微孔拓扑结构对体外细胞黏附和排列的影响，主要取决于凹坑的尺寸、间距、位置等拓扑特征。规则且分辨率高的微纳米凹坑可通过电子束光刻、光刻和成型技术制备。例如，利用标准光刻方法在硅表面刻蚀微柱，将聚二甲基硅氧烷浇铸在硅表面并固化过夜后，形成直径和间距为1-6 μm、深度为2.4 μm的聚二甲基硅氧烷微坑阵列，以研究其对人真皮成纤维细胞排列的影响，免疫荧光图像显示具有紧密间距的大尺寸阵列能够增强细胞排列[31]。Moroni等[32]在聚丙交酯-乙交酯膜表面制备深度、宽度不等的方形微坑进行成纤维细胞黏附和排列，细胞黏附率随着微坑深度的增加而增加；相比光滑表面，4 μm宽、15 μm深的方形微坑上具有更明显的细胞黏附和排列现象。此外，通过聚二甲基硅氧烷微坑也可控制海胆受精卵的几何形状(三角形、矩形、椭圆)，用于研究细胞形态对细胞核、纺锤体定位的影响，发现细胞核的定位主要由微管控制而非微丝应力纤维并位于微坑中心[33]。Ochsner等[34]同样将内皮细胞控制在微坑中，肌动蛋白纤维染色显示微坑内的细胞骨架呈现三维结构，而不是仅分布在细胞-基底的接触表面。因此，微孔可模拟细胞生长的三维微环境，用于大量单细胞的三维形状控制，对该种基底上细胞三维铺展动力学及其机制的研究将有助于认识相关特定的细胞生物学行为。相比微坑，纳米尺寸的凹坑基底与具有纳米孔的细胞外基质结构更加相似。直径为60 nm、间距为100 nm的聚己内酯凹坑阵列，可显著减少细胞在凹坑区域的黏附和排列，这可能是由于丝状伪足和黏着斑形成减少所导致[35]。此外，纳米坑拓扑结构同样会减少上皮细胞的黏附和排列[36]。这些结果可能表明，纳米坑拓扑结构通过干扰整合素的激活和聚集以阻扰体外细胞的黏附和定位，与机体细胞微环境有一定差异性，有待进一步研究和改进。 2.2.4 微波阵列结构近年来，由于波纹表面的新颖性、快速成型、廉价性，已被作为具有多尺寸拓扑形貌的结构而研究。通过拉伸和氧等离子束处理弹性模量不同的聚二甲基硅氧烷表面形成具有微波状的拓扑结构研究其对细胞黏附和排列的影响。与微沟槽表面细胞形态相比，微波结构更能促进牛主动脉内皮细胞的生长和排列；利用流动剪切应力对细胞黏附性检测发现，微波表面比平坦表面更有利于细胞的黏附和排列[37]。Luna等[38]利用波纹结构实现了鼠心肌细胞和人胚胎干细胞分化的心肌细胞及亚细胞结构的排列，仿生模拟心脏复杂的各向异性和多维度结构。通过模拟细胞外基质的纤维网络状结构，有望实现对蛋白的定位和检测。目前，大多数研究关注于静态波纹状基底对细胞体外排列的影响。Yang等[39]将丙烯酸丁酯和丙烯酸叔丁酯两种单体在交联剂和光敏引发剂作用下混匀，利用拉伸和不同温度下凝胶的溶胀性制备微波结构。基底在30 ℃无微波结构形成时，人脂肪干细胞的排列方向随机； 37 ℃刺激波纹拓扑结构形成后，细胞和细胞核以平行于微波方向排列。动态波纹基底对细胞的影响研究为激发微波形成实时控制细胞排列提供了新思路。 2.3 纤维支架由于纤维支架的微观纳米结构类似于体内细胞外基质的特性而被广泛应用于组织工程[40]。通过调节纤维支架的形状、维度等特征可调控体外细胞排列。例如，采用静电纺丝技术可制备一种热敏性纤维支架，即在保持支架内细胞活性状态下，通过改变支架纤维的形状或内部结构控制细胞形态等生物学行为[41]。平行分布的明胶纤维能够接触诱导许旺细胞及其轴突体外排列；但与无规则纤维相比，定向排列的纳米纤维降低了细胞的黏附和增殖速率[42]。整合素αVβ3和α5β1的差异性表达是细胞感知细胞外基质纳米几何结构的重要介导，纤维支架尺寸的减小会使得形成的应力纤维减少[43]。而Vimal等[44]在保持纤维其他物理特性不变的条件下，比较非定向、中度排列和高度排列的纤维支架对细胞的影响，结果表明中度排列和高度排列的纤维会促进U373细胞的定向生长，排列度越高的纤维支架会增大细胞和细胞核的纵横比，提高U373细胞的接触诱导。"

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